제 1 장 분자생물학의 역사

1.1. 전달유전학 (Transmission Genetics)

    * G. Mendel,

    * T. H. Morgan

    * Gene, phenotype, dominant, recessive, allele, filial, diploid, haploid, homozygote, heterozygote,

        gamete, chromosome, linkage, autosome, sex chromosome, loci, wild-type, mutant, recombination

1.2. 분자유전학 (Molecular Genetics)

    * Table 1.1. (p13)

    * DNA, protein, peptide bond, enzyme, mutagen

    - DNA and Gene

    - Gene ?

    - Gene & protein

    - Gene function; replication and expression

    - Gene cloning; technology

제 2 장 유전자의 분자적 특성 (Molecular characteriziation of genes)

    1. Genetic material ?

        -RNA & DNA

        -Experimental approaches; Bacterial transformation,ultra centrifugation, EP,

                                            UV spectrophotometry, atomic composition

    2. Chemistry

        - Bases; Adenine, Guanine, Cytosine, Thymine, Uracil---

        - Pentose sugars; ribose, deoxyribose---------------------

        - Phosphate; phosphodiester bond-------------------------------

        - Double helix

        - complement

        - semi-conservative replication

    3. RNA gene

    4. Physical-chemistry of nucleic acids

        - A, B, Z form

        - Denaturation; melting <- temperature, DMSO, urea, formamide

            ->Tm; temperature for 1/2 DNA melting

                -> highly dependent on GC content in DNA

        - Absorption; 260nm/280nm

            -> 1.0 means 50 µg/ml DNA at 260nm

                ->260/280;

                    -pure DNA = 1.8

                    -pure RNA = 2.0

                    -mixed protein <1.0

        - Hyperchromicity in ssDNA/RNA; ~40% absorption ascend

        - Renaturation of dissociated DNA; annealing

            -> factors affected; temperature, DNA conc., time

            -> Cot; DNA conc & time value

                -> Co; initial DNA cocn., t; second

                    ->Cot1/2; half renaturation

                        -> compare polyAU with T4 phage DNA; 2 x 10⁵   times higher => Cot1/2  = 0.4

                            => complex DNA requires more time and DNA

                                => Complex DNA gets higher Cot1/2

                        ->Able to estimate Genomic composition in an organism; repetitiveness in higher organisms

                -> Represent genomic comlpexity (C-value)

        - Hybridization; DNA to DNA, DNA to RNA, RNA to RNA

제 3 장 유전자 기능의 개요

    1. Storage of Genetic information; Hard disc??

                          R-transcription                               ???

        Genes <=====================>RNAs ====================>Protiens

                            Transcription                            Translation

       - Codon,

        - Template (transcribed) strand = anti-coding strand = sense strand **

        - Transcripts; all kind of RNA

    3. Protein function

        - metabolic pathway; phenylalanine degradation into harmless chemicals

    4. Messenger RNA

        
Ch.1. DNA replication and repair

-DNA의 복제와 수선
  proteins in bacterium
  proteins in eukaryotes

             DNA <----> RNA ----> Proteins

-핵산의 구조; 당 + 인산 + 염기
-Replication; require DNA melting
-DNA polymerase (중합효소)
-Damage; require repair
    => mutation; inherited; evolution force

1.2 Replication of DNA
1.2.1. Meselson and Stahl Exp.
   - Semi-conservative way of DNA replication
    => heavy N15 and light N14
   1) 초기에 여러 세대를 무거운 질소가 포함된 질소로 배양
   2) DNA 추출과 원심분리; 한 개의 띠; N15
   3) 1)의 대장균을 가벼운 질소와 20분간 배양
   4) DNA 추출과 원심분리; 한 개의 띠; N14.5
   5) 4)의 DNA를 단일가닥으로 만들어 원심분리; 두 개의 띠

1.2.2. Requirements for DNA replication
   -Template, Mg+, dNTPs, DNA polymerase
     => 그림 1. 3

1.2.3. DNA polymerases;
   1) In prokaryotes; 3 types, I, II and III (표 1. 1a)
     => Two functions; 모두 polymerase and exonuclease activity
       I; 손상된 DNA 수리용, 하나의 아연 원소 포함
          5'-->3' 방향으로만 합성. 2가지의 exo. activities.
      II; 기능 불분명, no 5'-->3' exo. activity
      III; 7 subunits, principal replicative enzyme
   2) In eukaryotes; 5 types; a, b, g, d, e (표 1. 1b)
      -a, d; chromosomal DNA의 복제용
      -b; 1 subunit, DNA repair
      -g; Mitochondria에서 발견됨, Mt DNA 복제용
      -e; d와 유사한 기능
   3) Reverse transcriptase; AMV; Mr. 160,000 + 2 Zn

1.2.4. DNA replication in E. coli
 - circular DNA, double strand DNA (dsDNA)
 - replication bubbles; DNA 복제가 시작되는 곳.
    => replication forks (1. 4), Same as Mt DNA (1. 5)
 - 박테리아 염색체의 항상 같은 자리에서 시작된다.
    => oriC site; 245 bp; 복제원점
 - leading (5' --> 3') and lagging strand(3'--> 5') (1. 6)
    => Okazaki fragment; 불연속 복제, 1-2 kb, DNA  ligase에 의해 봉합됨. (1. 7)
 - RNA primer; required for DNA synthesis.
    => primases라 불리는 특수한 효소에 의하여 생성 => form primosome with several
        polypeptide  chains
    => primosome은 5 - 10개의 특정한 염기서열을 인식.
    => primase가 특정한 DNA를 인식할 때는 N-protein의 도움이 있음.
    => RNA는 DNA polymerase에 의하여 제거되며, DNA로 채워지고 DNA ligase에 의하여
        연결된다  1.2.5. q-구조
 - circular DNA forming theta structure (1. 8)
    => clockwise/anticlockwise directions
 - 800 bp/sec(= 80 revolutions of unwind)
 - unwinding of the DNA; induce supercoiling
    => untwisting of the double helix; (-) supercoiling
    => overtwisting; positive supercoiling (1. 9)
 - Topoisomerases; DNA의 형태를 빠꾸어줌
    => I; supercoiled DNA를 이완 시킴, 방출 (1. 10)
    => II; also called gyrase, negative supercoils 형성
            catenated DNA의 방출 (1. 11)
<Helicase>
 - aid the unwinding of the parental DNA 분자 (1. 12)
 - ATP 요구성 (cofactor)
 - 2 가지가 참여; 하나는 leading strand synthesis (3’-> 5')  또 하나는 primase와 복합체를
   형성 RNA primer를 만듬.

<SSB-protein>
 -helicase에 의해 노출된 ssDNA을 안정화하여 복제가   쉽도록 한다
    => SSB 단백질의 제거시에는 주형의 DNA가 hairpin을 형성하여 복제를 불가능케함.
 -복제와 관련한 단백질의 기능 요약 (표 1. 2).

<DNA ligases>
 -polynucleotides 사이 phosphodiester결합의 형성을 촉매
 -RNA primer가 제거된 Okazaki fragment의 연결에 관계
    => Damaged DNA의 수선에 관계 (1. 13)
 -one in prokaryotes, two in eukaryotes
    => both function in the nucleus

1.2.6. DNA replication in eukaryotes
 -원핵생물과 근본적으로 유사함.
 -단, 여러개의 염색사로 구성된 많은 DNA를 가지는 복잡성이 있다.
    => polymerase의 이동성이 그리 높지 않으나, 진핵생물은 2만 분자 이상의 DNA
        중합효소를 가짐.
    => 이는 최소 2천개 이상의 replication fork을 형성 할 수 있어 복제 속도를 높인다.
    => 작은(40-300bp) Okazaki fragment로 합성.
 -즉, 전체적으로는 훨씬 빠른 복제를 가능케 한다.
 -실험적으로 viral DNA가 사용되었다
    => adenovirus/SV40 (1. 14)
    => Pol. delta; 선도 가닥 합성
    => Pol. alpha; 후속 가닥 합성.
 -Require histones dissociation and reassociation
 -Histone 단백질의 합성은 DNA와 동시에 이루어짐.

1.2.7. The cell cycle (세포주기); 그림 1. 15/ 1. 16

1.2.8. Mt and Chl DNA replication
 - D-structures (1. 17)

1.2.9. Viral DNA replication
 - 핵산의 종류가 다양한 만큼 복제 방식도 다양함.
 - 예1) T7 phages; linear dsDNA; primases, DNA중합효소, SSB단백질을 만든다
    => ssDNA의 말단으로 반복된 genome unit형성 (1. 18)
 - 예2) Retroviruses; ssRNA를 genome으로 가진다.
    => RNA> DNA> RNA, reverse transcriptase (1. 19)

1.3 Proofreading during DNA synthesis
 - 고도의 정밀도를 가진 DNA polymerase가 사용됨.
     => 108 - 1012에 한 개 정도의 오류를 유발함.
     => 돌연변이의 최소화와 생존 및 종족의 유지
        => mutation> defect> low quality
 - 원핵생물의 모든 DNA polymerase는 부정확한 염기쌍을 제거하기 위한 exonuclease
    활성을 가진다.
     => proofreading (교정 기능)
 - 진핵생물에서는 exonuclease 활성이 delta와 epsilon에만 있다.
 - Mt DNA는 높은 변이율을 보인다
     => 중합효소 gamma는 exonuclease 활성이 없슴.

1.4 Mutation and repair DNA
 - DNA damages; by Radiation, chemicals, spontaneously
 - 제 8 장에서 구체적으로 다루게됨.

<RNA의 기능>
   mRNA; specifies the primary structure of proteins
   tRNA; amino acids carriers
   rRNA; factory for polypeptide formation
    => larger precursor molecules이 존재함 (=primary transcripts)
       => 이들이 가공되어야 생물학적으로 기능하게됨.

<특수한 RNA들>
- 진핵생물의 경우 세포질의 mRNA는 훨씬 큰 전구체로부터  유래하는데 이를 hnRNA
   (heterogenous nuclear)라 한다.
     => 여기에는 mRNA에는 존재하지 않는 내부 서열이 있다.
        => called intron
- 또한 진핵생물의 핵내에는 6 가지의 작은  RNA가 존재한다.
     => 이를 small nuclear RNAs (snRNAs)라 한다.
        => 역할; hnRNA를 기능성 mRNA로의 가공 과정에 참여.
     => 세포질내에는 tRNA와는 구별되는 작은 세포질 RNA가
           존재한다. 이를 small cytoplasmic RNAs (scRNAs)라 한다.
- 진핵 및 원핵 생물의 몇몇 RNA는 효소의 기능을 가지는  direct catalytic function
   (자기촉매기능)을 가진다.

<그 외의 특징>
 - 진핵생물의 대부분 RNA는 post-transcriptional modification  (전사  후 가공)의 과정을
    거친다. (Not in prokaryotes)
 - 모든 RNA는 분자내에 있는 상보적인 염기서열에 의하여  2, 3차 구조를 만든다; 생물학적
    기능에 중요함.
 - 모든 RNA는 영구적으로 또는 일시적으로 특정 단백질과 연관되는 ribonucleoprotein
    complexes (RNPs, RNA-단백질 복헙체)를 형성.
    => 이는 RNA의 대사와 해독과정에 매우 중요하다.

2.2 Ribosomal RNA
 = ribosome; 가장 풍부한 세포내 소기관, 단백질의 합성 기구
  - 대장균 세포의 1/3 (mass)을 차지하는 풍부한 구조물.
  - 라이보좀 부피의 1/2은 rRNA가 차지함.
    => 가장 풍부한 RNA (약 70-80%); 이유는 단백질처럼 해독에 의한 증폭이 일어나지 않기
        때문이다.
  - rRNA유전자는 대부분 반복되어 있음; repeated (gene family)
  - 분자량; 2.5 - 4.5 x 106 Da
  - 3가지 부류; 초원심 분리에 의한 침강계수
      => 70S; 진정세균 및 엽록체
      => 80S; 진핵생물
      =>  50S; 포유류의 미토콘드리아
  - 두개의 기능적, 구조적 단위체 (subunits)로 구성
  - 이들은 Mg이온 농도가 낮아지면 해리됨. (2. 1)
  - 80S 중의 60S에는 3가지의 rRNA와 45 가지의 r-proteins
  - 70S 중의 50S는 2가지의 rRNA와 34 가지의 r-proteins
  - 진핵과 원핵의 small subunit은 1가지의 rRNA와 21-23 종류의 r-  protein을 함유.

<대장균의 라이보좀>
  단백질; 상당량이 basic a.a.
   - S1 --- S21
   - L1 --- L34
   - 평균분자량은 17,000 Da
      (그림 2. 2, ribosomal proteins의 cross-linking)
      (그림 2. 3, 대장균 라이보좀의 형태)

2.2.1. Ribosome assembly
  - most complex subcellular structures
  - self assembly
  - high salt + urea => 분리를 유도

2.2.2. Functions of individual....
= 다양한 기능을 수행; 단백질의 합성에 필수적인 요소
    - peptydyl transferase,
    - codon-directed binding of aminoacyl t-RNA
    - binding mRNA
    - initiation factors
    - elongation factors
    - termination factors
    - GTPase activity
= Large subunit in E. coli; 5 proteins for polypeptide form.
  16S rRNA; mRNA의 결합에 관여 (Shine-Dalgano sequence)
  28S rRNA; for elongation
  rRNA; has direct catalytic activity in protein synthesis
  remains to unknown

2.2.3. rRNA의 구조
  - 생명과학의 발달로 점차 그 구조가 명확히 규명되고 있음.
  - 다양함; 표 2. 1
  - 2차 구조를 형성; double helical  stems, single-stranded loops, (2. 6)
     진화상 잘 보존이 됨.
  - 1차 구조의 특징은 nucleotide의 methylation에 의한 변형이다. (by RNA methylases)
     - use S-adenosyl-methionine (SAM) (2. 7 and 2. 8)
     - 원핵생물; base methylated (as in 5-methylcytosine)
     - 진핵생물; 2'-OH ribose residues (as in 2-methyl adenosine)
  -  Methylation의 부위는 매우 높은 진화적 보존성을 보임
     - rRNA의 1차 전사체의 processing에 역할.

2.2.4. The processing of rRNA
= Large rRNAs는 대형의 전구체 (pre-rRNA)로 부터 변형 (modification)과 가공 과정
  (processing)을 거쳐 완성됨.
   - processing은 인 (nucleolus)에서 일어남 (그림 2. 9)
   - Pre-rRNA (45S, 12,000 nt); 최초의 전사체
   - 인 형성체내의 염색체에 집단으로 존재하는 유전자로부터 나옴.

<45S pre-rRNA의 변형과정>
    1) 먼저 pre-RNA의 특정한 nucleotide에 110여개의 methyl기가  첨가된다.
    2) ribosomal proteins가 인으로 세포질로 부터 도입되며 pre-RNA와 결합함.
    3) 일련의 endo- and exonucleolytic events에 의해 중간체인 32S와 20S를 생성.
    4) 32S는 더욱 쪼개져 28S가 되며, 5.8S의 rRNA와 수소결합을 형성.
    5) 20S는 18S로 완성됨 (그림 2. 10)

= 5S rRNA는 독립된 다른 염색체의 유전자의 전사체 유래.
   - methyl화 하지만 완전한 크기로 전사됨.
   - 종에 따라서 최초 전사체와 중간체의 크기는 다양하다.
     => 변형과정은 유사함.
= 원생생물의 하나인 Tetrahymena thermophila의 경우
   - 35S는 정상적인 5'--26S ------ 18S--3’배열을함.
   - 그러나 Pre-rRNA 중 26S rRNA의 intron은 보존성이 없음 (그림 2. 11)
   - 인트론의 제거는 단지 monovalent cation, divalent cation, guanine nucleotide를 필요.
      => 인트론의 제거에 단백질을 필요로하지 않음.
          => called autocatalytic mechanism of intron removal and RNA splicing
          => Mt pre-rRNA와 곰팡이 및 효모에서 관찰

2.3 Transfer RNA (tRNA)
= Crick; 1950s, small RNA => serve for amino acids
    - 핵산을 주형으로한 아미노산의 중합을 예견
= 초고속 원심분리 (50만 g);
    - polysome을 포함하는 mRNA는 침강; rRNA/mRNA
    - 수용성은 녹아 있음; tRNA
    - 여기에 ATP와 방사선 표지된 아미노산을 첨가하면 RNA와 공유적으로 결합
    - 이들은 cell-free 단백질 합성 시스템에서 polypeptide의 합성을 위한 a.a.원이 됨.
       => cell-free system???
= 한 종류의 아미노산에 대하여 최소한 한가지의 이상의 tRNA 분자가  존재;
       => isoaccepting tRNAs

2.3.1. Transfer RNA의 구조
= 1차 구조 규명; Holley 등에 의하여 1960년대
    - chromatographic과 RNA sequencing 기술로 여러 tRNA의 구조 규명
= 2차 구조; folding the primary sequence
    - 분자내 수소결합의 최대화로 클로버 잎의 형태를 이룸.
      (Universal Cloverleaf structure) (그림 2. 12)
    - 예외; 일부 동물의 Mt tRNA에는 dihydrouracil loop가 없음.
= 특징; single chain, 73 - 93 ribonucleotide로 구성
    - 상당부분이 unusual bases로 구성됨
    - 표준의 염기와는 크게 다르며, 표준염기가  전사후 변형 과정을 통해 생성됨.(그림 2. 13)
    - 이들은 변이성이 낮으며 3차 구조 유지에 참여
    - 절반 가량의 nucleotides가 염기쌍을 이루며, 이중나선 을 형성
       => T C loop,
           anticodon loop,
           dihydrouracil loop (그림 2. 12)
    - 3’말단에 쌍을 이루지 않은 4개의 염기
    - 이중 마지막의 3개는 항상 -CCA-OH 3’
    - 아미노산은 말단 adenosine의 3’-OH에 에스터화한다.
    - 3차 구조; 그림 2. 14
= 종류; Class I; small extra arm (3-5염기구성), 75%차지
           Class II; Large extra arm (13-21염기구성, 5염기쌍의 stem)
= 구성; 4 major arms
    - acceptor arm (for aminoacylation)
    - T C arm (contain pseudouridine)
    - anticodon arm
    - D arm (contain dihydrouridine)
= 번호 붙임; 5’>>>>> 3’
= 대략 76개 짜리가 가장 흔하며, 74 - 95범위내에 있음
    - 크기의 차이는 D arm과 extra arm으로부터 기인함.
    - D arm은 17:1이 17과 18사이 및 20과 21 사이에 20:1과  20:2의 존재
    - 가장작은 것의 경우에는 17과 함께 이들이 모두 (17:1,  20:1, 20:2) 없다.
    - Extra arm은 변이가 가장 큼.
    - T C arm과 anticodon arm사이에 위치.
    - 이것의 특성에 따라 class를 분류
    - L-shaped molecule
= 그림 2. 15; 비정상적인 염기에 의한 염기쌍의 형성.
    - 수소결합에 의한 3차 구조의 유지
= 그림 2. 16; 최초의 아미노산을 위한 개시 tRNA는 다름.

2.3.2. Processing transfer RNAs
= 원핵/진핵 모두에서 전구체 분자로부터 시작
   - 다양한 processing events를 거침
= 대장균에서 tRNA유전자는 다른유전자들 (tRNA, proteins, rRNA 등)과 혼재함
   - 예를 들어 tyrU 오페론은 4개의 tRNA와 단백질 합성의 연장인자 (elongation factor Tu)를
      전사
   - 최초의 endonucleolytic cleavage; by RNaseP
   - 5’end of tRNA 분자를 생성 (그림 2. 17)
   - RNaseP; unusual enzyme; 375 RNA + protein
   - at high Mg++
   - RNA만으로도 효소기능을 함
   - further nucleolytic events and bases modification;
   - MATURE tRNA
   - CCA-OH 서열의 존재
      => 원핵세포는 유전자로 부터 유래하고,
      => 진핵세포는 post-transcriptionally added
= 진핵생물; 많은 tRNA유전자는 집단으로 존재
   - 가장 상세한 연구는 효모로 부터 이루어짐 (그림 2. 18)
   - RNaseP 유사 효소가 관여
   - 대장균과는 달리 intron (10 - 30 base)이 존재
   - 전구체의 3’말단에서 UU-OH가 제거되고, CCA triplet가  tRNA nucleotidyl transferase에
     의해 첨가됨.

2.3.3. Reactions of transfer RNAs
= 단백질 생합성의 중심역할
= 여러 종류의 분자들과 상호작용
   - amino acylation 등등, p34
   - 많은 효소들에 의한 인식부위가 있음
   - 인식부위는  개별의 tRNA 또는 isoaccepting species에  따라 특이적  이고, 공통적인면도
      있다
   - 특이성과 동일성을 공유하는 aminoacyl-tRNA synthetases에 의한 a.a.의 결합은 ???
   - a.a accepting stem, anticodon stem, dihydrouracil loop
      모두가 효소와 접촉  (그림 2. 19)

2.4. snRNA and scRNAs
   -특정 단백질 (90 - 300 nt)과 RNP를 형성.
     snRNAs; U1 - U6
   - U1, U2; for mRNA splicing
   - U3; for pre-rRNA processing, 인에서 발견됨.
     scRNA; 현재 알려진것은 7SL RNA
   - 포유류에 signal recognitiion particle (SRP)의 구성물.
   - 세포내에서 신호전이 등과 관련한 중요한 기능 (2. 20)

3.1 Introduction
 DNA --------> RNA

3.2 Transcription; the basics
= 효소; DNA-의존성 RNA중합효소; promoter와 높은 친화성
   - DNA 이중나선의 국소적 변성 (melting)을 유도
   - ATP, GTP, CTP, UTP와 보조인자로 Mg++ or Mn++
   - 개시는 Purine 염기(A or G)로 시작; 상보성에 따른다.
      => form 3’---- 5’ phosphodiester 연결로 합성이 진행됨.
      => 일시적인 RNA-DNA hybrid 형성; 12bp (그림 3. 1)
   - RNA는 5’------->  3’방향으로 신장
      => 전사 bubble 형성; 전사는 DNA의 3’-------> 5’를 주형
   - 전사의 개시에 primer를 필요로 하지 않음.
   - 일반적으로 두가닥의 DNA중 한가닥만 전사됨.
      => one gene; one discrete section of DNA
   - RNA 중합효소에는 교정기능이 없다.
   - 전사단위 (transcription unit); seq. of DNA transcribed into RNA; 여기서 합성된 것을 1차
      전사체라함.
       => 이들은 생물학적 기능을 위하여 격심한 변형(가공)이 요구됨.

3.3 Transcription in prokaryotes
= The RNA polymerase of E. coli
   => 그림 3. 2; footprinting tech.
   => 그림 3. 3; 대장균의 promoter seq.
   => 그림 3. 4; 열충격 promoter
   => 그림 3. 5; 프로모터에 대한 점 돌연변이 실험

3.3.1. Heat-shock promoters; 열에 대한 반응.
= Heat-shock response; 열 충격 반응
    - 열 충격에 따른 단백질 합성의 변화 유도.
       => 정상적인  생활의 단백질 합성을 중단.
       => 단백질의 변성으로 부터 생명을 보호.
    - 17 종의 열 충격 단백질이 발견됨.
    - 발현은 hptR 유전자의 생성물에 의해 촉발됨.
    - hptR은 열충격에 반응; codes 32 kDa protein
    - sigma factor의 변형체임; called  32
    - form  2' 32; bind only to the heat shock genes; heat-shock promoter
    - heat-shock promoter는 일반의 유전자와 -10 bp부위가 다르다. 또한 -35 seq.도 차이를
      보임 (그림 3. 5)

3.3.2. Initiation and elongation of RNA chains
(1) Initiation; at -35bp  --------   -10bp
   - RNA polymerase의 결합으로 개시
   - 1st; formaton of closed promoter complex (그림 3. 6a)
      => to double helical DNA
   - 2nd; formation of open promoter complex (그림 3. 6b)
      => RNA중합효소가 결합한 부위내 -17에서 수소결합의 깨짐
      => B-DNA의 1.6 회전만큼이 열린다
      => 첫번째 nt인 ATP나 GTP가 beta subunit에 결합; 합성개시
   - 3’>>> 5’방향의 주형에서 5’>>> 3’의 RNA 합성 최초 12nt가 합성되면서는
     떨어져나옴.
   - 합성이 종결될 때 까지 unpaired 17bp 공간의 전사 bubble형성
      => 인접한 RNA는 12염기쌍의 DNA-RNA복합체를.
   - mRNA의 반감기는 수 분 정도임; RNase에 의해 분해됨
   - 원핵생물에서 전사와 해독은 거의 동시적임 (그림 3. 7)

(2) Termination of RNA synthesis; 두가지 방법
   첫째; 부속단백질인   factor에 의존하는 경우
   둘째;   factor에 의존하지 않는 경우
 1)  factor-독립성 종결
     - DNA에 GC-rich seq.에 의한 dyad symmetry와 5-6개의 아데닌의 염기의 연쇄로 된
       특성.
       => 이는 전사된 RNA가 상보적인 염기사이에 수소결합에 의하여 stem-loop / hairpin을
            형성하므로 이루어짐 (그림 3. 8)
       => oligo(U)는 DNA-RNA duplex에서 가장 불안
       => 자동 해리 및 종결

 2)   factor-의존성 종결
   역시 stem-loop구조를 요함; 그러나 oligo(U)는 없음.factor는 6개의 동일한 subunits로
   구성됨;
      => 분자량은 46,000임.
      => ssRNA에 높은 친화성이 있음.
      => 이는 ATP를 가수분해하고 그 자유에너지는 전사 bubble에
           인접한 RNA 로 인자의 이동을 유발하고, 이는 DNA-RNA 복합체의 분리와 mRNA의
           해리유도  (그림 3. 9)

(3) Divergent trancription (그림 3.10)

3.4. Transcription in eukaryotes
 = 전사기구는 훨씬 복잡; 중합효소 및 DNA에 다양성.
 = 전사는 전체 genome의 10% 정도만이 발현됨.
    => 상당량의 DNA가 고도로 응측된 상태 (condensed)
    => called heterochromatin (이질염색질)
 = 발현이 일어나는 부분은 loosely packed euchromatin
 = Require transcription factors; specific accessory proteins
    => 효율적인 전사에 요구됨.
         => 이 단백질은 박테리아의 시그마 인자와는 달리 RNA 중합효소와  직접적인 상호작용
             하지 않음.
         => 이들은 전사 개시전에 염색사와 안정된 복합체를 형성하고 positive regulator로
             작용함.
    => 연구가 진행중임.

3.4.1. Eukaryotic RNA polymerases
 = Three types; I, II and III; by elution profile (이온 교환)
      => 핵 내에서의 위치, 전사하는 유전자의 형태, polypeptide subunit 구성에 따라 특성이
           나타남. (그림 3. 2)
         I; 인에 위치, 인 형성체내 rRNA 유전자 전사
         II; 핵질에 위치, protein-coding genes를 전사
         III; 핵질에 위치, 5S rRNA/tRNA 유전자 전사
 = 분자량; 50만 이상,
      => 10만 이상의 두개의 subunit는 중합기능
      => 12개의 small subunit으로 구성.
 = 진핵의 중합효소와 DNA만으로 전사의 개시가 불가능
    =>why ?

3.4.2. Methods...
  Introduce mutations in the putative promoter regions
  Three types of test system;
  1) 부분정제된 RNA중합효소를 사용한 in vitro system
  2) The oocyte system; microinjection of cloned DNA
  3) In vivo system; transfection with cloned DNA

3.4.3. Transcription by RNA pol. I
 = 가장 높은 발현을 보임; high demand of rRNA
    => 100개 이상의 효소가 하나의 유전자에서 작용    (그림 3. 12)
 = rRNA 유전자는 종간에 유사도가 높으나, 전사개시부 주변의 upstream seq.의 종간
   특이성은 놀라운 발견
    => promoter는 약 150개의 염기로 구성되어  -140 >>  +6 사이에 위치
    => 완전한 promoter seq가 spacer region에도 존재
    => 반복된 61/80 bp는 전사효율을 극대화함 (그림 3. 13)
    => 중합효소는 spacer region에 queue up >> 이들은 TRUE PROMOTER에 이동함

3.4.4. Transcription by RNA pol. II
 = for mRNA (protein-coding gene)
     => housekeeping genein all tissues
     => tissue specific genes
     => regulated genes by 특정 기질/ 호르몬/환경자극
          (그림 3. 14; 고등생물의 promoter부분)
= TATA/Hogness box is common but not universal
     => TATAAAT at -25; promoter function에 필수적
     => 보다 앞쪽은 GC-rich로 채워지는데 개시부의 인식기능을 함.
=  CAAT-box; a common feature at -80; GGCAATCT
= GC-box; housekeeping유전자에 있는 일반적인 특징
     => 위치는 다양함; GGGCCGGG
     => 이들 consensus seq.는 specific transcription factors의 결합에 기능; Pol II와 직접
         상호작용은 없음.
     => 포유동물의 sp1 단백질은 GC-box를 가지는 유전자의 발현에 요구
     => enhancer; 효율적인 발현을 위하여 존재함.
         => 부수적 seq.>>>자체로써 promoter의 기능은 없음.
          => 전사를 극대화함, 유전자의 5’upstream의 수 kb앞에 위치 or
              3’부위/intron내에도 존재할 수 있음. 유전자 발현의 조절자로 기능
             (예) 그림 3. 15; steroid-hormone
= 대부분의 전사체는 3’말단에 AAUAAA를 가짐 at 20
     => 종결 및 poly(A) tail signal

3.4.5. Transcription by RNA pol. III
- for 5S rRNA/ tRNA/ snRNA/ scRNA
- 비교적 작은 유전자 발현용; 대개 300 nt정도
- 5S; no intron
- tRNA; small intron
     => 개구리의 난황내 5SrRNA유전자의 promoter는    ORF내에 존재
         (그림 3. 16)
     => 발견된 전사인자; TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC

4.1. Introduction

=유전정보의 발현 마지막 단계; 해독과정
  - protein synthesis by ribosome, tRNA, protein factors
=해독과정은 기본적으로 동일; 원핵과 진핵은 얼마간의 차이가 있다.
  - 진핵생물에서 보다 복잡하다.
=세포질에서 작동한다.
  - Mt. and chloroplast도 자체의 작동기구를 가진다.
    => 박테리아와 유사
=Ribosome; translation factory (그림 4.1)

4.2. mRNA
=구조; 그림 4.2
=n.t bases의 직선 서열 자체가 유전암호
 - 5’ leader seq.; 5’UTR; mRNA에 따라 크기 다양함
   => ribosome의 결합과 관계
 - Initiator; AUG; for Methionine
 - coding region; mRNA에 따라 다양함
 - STOP; UAA, UGA, UAG
 - 3’UTR; variable NON-CODING seq.

=진핵생물에서는
 - 5’Cap at 5' end; ribosome과 상호작용에 중요 (그림 4.3)
 - Poly(A) tail; 3'end 100-200 n.t
 - added post-transcriptionally
 - Not known well
   => 핵산의 분해로 부터 보호 (?)
   => 전사의 개시와 관계 (?)

4.3. tRNA and aminoacyl-tRNA synthesis
= Acts as adapters; mRNA와 a.a.사이의 다리역할 (tRNA is a enzyme ?)
= tRNA는 특이적으로 mRNA와(codon-anticodon interaction) tRNA에 상응하는 아미노산을
  부착하는 효소 (aminoacyl-tRNA synthetase)와 인식되어야함
  (BOX 4.2 Wobble hypothesis)

= a.a.의 tRNA에 부착; 각각의 a.a.를 위하여 특이적인 aminoacyl-tRNA synthetase의 촉매가
   요구됨.
 - 20가지의 필수 아미노산이 요구되므로 최소 20가지의 aminoacyl-tRNA synthetase필요.
   예) alanyl, arginyl, asparaginyl etc.,
 - 수 종류의 tRNA가 존재하고 한 종류의 a.a를 여러개의 codon에 의해 인식되지만, 특정한
   각 a.a에 대해서는 한가지의 aminoacyl-tRNA synthetase에 의하여 촉매됨.
 - 기작은 아직 불분명

=aminoacyl-tRNA synthetase는 분별 및 선택기능이 있다.
 - cognitive tRNAs; correct tRNA for a given synthetase
 - isoaccepting tRNAs; 한 종류의 a.a.와 결합하는 tRNA를 말한다.
 - proof rreading은 aminoacyl-tRNA synthetase에 의해 이루어진다.

=Aminoacylation 과정은 두 가지의 기능을 제공
 1) 첫째는 아미노산과 핵산을 연결하는 첫 번째의 연결고리이다.
 2) 활성화된 아미노산을 유도한다.

=Aminoacylation; by two steps
 1) a.a.가 먼저 ATP와 반응
     =>활성화된 aminoacyl adenylate 형성 (그림 4.4)
 2) aminoacyl unit은 tRNA로 전이

=proof reading; see Box 4.3
=CODON BIAS; 종에 따라서 codon의 사용 빈도가 다르다.
 -예로 serine으로 6개의 codon에 의해 인식되나 모두 사용되는 것은 아니다.

4.4. The ribosome cycle
=mRNA의 해독과정을 의미함 (그림 4.5)
 - Initiation; 표 4.1
 - initiation complex; 개시 복합체
=two ribosomal complex
=one molecule of mRNA
=initiatior tRNA(carrying methionine)
 - Elongation; 5’>>>>> 3’그림 4.6
 - forming polyribosome; polysome
 - Termination;
 - by STOP codon

(1) Initiation codons and tRNAs
 -Start with AUG or GUG (in E.coli)
  =>매우 드물게 AUU, UUG
  =>AUG codes for Methionine (the only codon)
 -개시자인 AUG와 아닌 AUG의 Met는 어떻게 구별 하는가?
  =>대장균에서는 formyl-methionine; tRNA^Met/f
  =>진핵생물에서는 unmodified methionine

(2) Steps involved in the initiation of translation
 -원/진핵생물간에 다소의 차이는 있으나 유사하다.
  =>Elongation을 위한 구조 형성
  =>각각 독특한 IF/eIF 요함; 원/진사이 큰 차 (표 4.2)
 1) Peptide chain initiation in bacteria
  -특징; mRNA와 30S ribosomal subunit의 rRNA와  직접적인 접촉 (그림 4.8)
   => 개시 코돈의 인식
   => 5’의 leader seq.는 poly(U)를 가지는데, 이는 16S rRNA의 3’말단에 pyrimidine-rich와
       상보적임 (그림 4.9)
   =>염기쌍의 형성이 가능함(correct initiation)
       =>called Shine-Dalgano seq.
  - Ternary complex; IF-2-GTP-fMet-tRNA^Met
  - polycistronic
 2) In eukaryotes
  - 원핵생물과는 크게 다르며 복잡.
  - 최소한 10개의 개시인자를 요함.
  - No Shine-Dalgano seq. in eukaryotes
  - Also, no CCUCC seq. in 18S rRNA
  - Monocistronic; Scanning model by Kozak (4.10)
   => 먼저 작은 subunit가 mRNA의 5’말단에 부착하고 5>>>3’방향으로 이동하며 AUG를
       찾아감.
   => 여기에는 ATP를 소모하며, 5’-cap이 포함됨
   => 95%가 개시 at AUG (그림 4.11)
 - 그림 4.12; 개시과정의 요도

(3) Elongation; decoding of mRNA
 - 5’ >>>> 3’; mRNA의 언어에 따라서 polypeptide화
 - N-terminal >>>> C-terminal
 - 원핵/진핵에서 유사
 - 순환적 과정임
 - Elongation factor를 요구함; (그림 4.3)
 - A site; aminoacyl or acceptor
 - P site; peptidyl
 - 전 과정은 그림 4.13에 상세히 나타남.

(4) Termination
 -by release factors (표 4.4)

4.5. Fifelity of translation
 -고도로 정교함
 - Error rate; one in 3,000 a.a.

4.6. Post-translational modification
=다양한 형태의 covalent modification이 일어남
 - Limited proteolysis
  => remove N-terminal residues
  => Met./ formyl-methionine
  => zymogen activation and removal of signal pep
 - Glycoslation
 - Disulfide bond formation
 - Addition of prosthetic group
 - Phosphorylation to serine, threonine and tyrosine
 - For regulation of the activities or function
=Critical for biological function

4.7. Inhibitors of translation

5.1. Introduction
=전사와 해독 자체만의 의미는 크다. 그러나 이후의 변형 과정 또한 매우   중요하다.
=RNA processing or post-Post-transcriptional modifications
  -진핵에서 전사와 해독의 중간과정에서 일어남
  -hnRNA====>>>>modification (5.1)
=protein processing or post-translational modifications
  -모든 생물에서 단백질의 변형과정은 주요 과정
    =>for functional proteins
    =>하나의 polypeptide사슬도 여러방향으로 변형가능
    =>활성이 달라질 수 있음 (5.2)
    =>왜냐하면, unprocessed polypeptide는 대부분 불활성
  -단백질 활성의 조절이 주요 목표임

5.2. mRNA processing
=Not in prokaryotes.
=자궁암 조직의 pulse-labelling기법으로  최초 확인
 -핵내에 최초 전사체는 평균 6kb (각각은 200 bp-- 30 kb 까지 ;called hnRNA: (5.3)
 -30분 후에는 그 크기가 작아짐
   =>약 1500 n.t
   =>이들은 세포질로 이동; 전체의 5%에 해당함
   =>나머지는 핵내에서 분해됨
 -무슨일이 일어나는가?

5.2.1. Capping of eukaryotic mRNA
=최초의 전사체에 5'-end는 5拉pppPupN................3’이며
 -Pu; purine residue
 -N; sugar base component
 -P; phosphate group
=변형 후의 5’말단은 다음과 같이 보다 복잡한 구조.
  5’-7mGpppPupN..........3’; called cap
 (7mG는 변형된 n.t.인 7-methylguanosine;
  => g-phosphate 제거 >> Guanosine부착 >>methyl group부착 basic Cap 0 구조
      형성>>further methyl group 제공 5’-7mGpppPupN (5.4)
  => Cap의 정확한 기능은 불분명; 전사에 필수
      => 해독 초기ribosome부착을 위한 인식 부위.

5.2.2. Methylation of internal......
=빈도는 매우 낮음; 염기 1000 중에 하나 발생
 -하나/둘의 methyladenines in euk. mRNA; 필수요소는 아님

5.2.3. Polyadenylation
=At 3’-end
=poly(A) tail의 첨가; upto 200 adenosine residues
  - form 5’...pNpNpA(pA)npA-3’
=무조건 3’말단에서 일어나는것이 아니라
  - 일단 3’말단의 poly(A) signal의 10-30 부위에 소수의 n.t가 제거된 후 부착
 -5’-nnnAAUAAAnnnnnnnnnnnnnnnnAAAAAAAAAAAA--3’
  =>by poly(A) polymerase (5.5)
=해독에 필수 요소는 아닌 것 같다.
=histone단백질의 mRNA는 poly(A)가 없다
=poly(A)가 mRNA의 반감기를 결정하는 듯. (Box 5.1)

5.2.4. Introns and intron splicing
= Splicing of intron; RNA분자의 큰분절을 제거; 1977발견
  - Intron의 존재 확인(DNA seq과정의 불일치 관찰)
   (5.6); regions of non-coding DNA
  - intervening seq. ; only in euk.
= exon; coding sections
= 진핵생물의 유전자는 불연속(discontinuous genes);
  - called split or mosaic genes
  - in euk/virus but NOT in bacteria (표 5.1)
=Intron의 숫자는 유전자/종에 따라 다양
=Intron should be removed;
=exons joined to one another before translation
 - 이를 SPLICING (cutting and rejoining)이라함

<The nature of the splicing pathway>; 특징
 1) Intron의 앞과 뒤; 5’-GT-----AG-3’(5.7)
 2) snRNA가 관여함; 7가지 (U1------U7)
  - n.t.의 수가 65(U6)에서 215(U3)
  - snRNA는 snRNP(ribonucleoproteins) 내에 존재
 3) 3단계의 splicing reaction
  1단계; 5’splice site에 분절화
  2단계; lariat formation
  3단계; 3’splice
   =>exons joining
 -spliceosome; RNA-protein complex (see handout)

5.3. Transport of processed mRNA to the cytoplasm
=핵공을 통하여 방출되나 정확한 기작은 연구중..
 1) hnRNA processing; 30분 내외
 2) 이동; to cytoplasm
 3) 해독; 1-5분 내외

5.4. Post-translational modifications of proteins
=초기의 polypeptide는 기능적이기 위하여 변형
 -be functional;
 1) three-dimensional conformation
 2) modification by chemical
  - alteration a.a 또는 lipid/carbohydrate의 부착
 3) cleavage
  - N-말단 or C-말단 or 양쪽 말단 모두 (5.9)

5.4.1. Protein folding
 1) 아미노산의 위치 선정에 의한 수소 결합(친수/소수)
 2) 곁가지의 부착을 위한 steric requirement
 3) 겹치기를 돕는 disulfide bond formation (S-S)
 4) signal peptide의 제거
 5) proline, lysine 잔기 등의 hydroxylation (OH)
 6) gamma-carboxylation of glutamate
  (in 혈애응고와 칼슘 결합 단백질)
  =>단백질의 기능과 활성에 필수적임 (5.10)

5.4.2. Chemical modification of amino acids
=비교적 간단한 화학적 변형;
=acetyl, methyl, phosphate, hydroxyl, carboxyl (표 5.2)
 - N 말단의 a.a. 아미노 그룹에
 - C 말단의 a.a. 카르복시 그룹에
 - 중간 부위의 a.a. 측기에
=현재 140 가지 이상의 변형된 아미노산 잔기 확인.
=특정한 아미노산의 자리에만 일어나며 정교함.
 예; 히스톤 H3; 135 a.a 구성, 12개 lysine 잔기
   =>4개의 잔기중 2개는 methylated, 2개는 acetylated (5.11); 항상 같은 위치에
=또 하나의 예는 collagen (표 4.3)
 -변형으로 3-hydroxyproline와 4-hydroxyproline생성 (5.12)
   =>복잡; 조효소로써 산소, 철이온, vit.C,
   a-oxoglutarate요구
  =>hydroxylation의 위치는; Gly-X-Pro for proline

<변형된 아미노산의 기능>
=콜라젠의 예;
 - 3개 개별 polypeptide로 구성
 - 대량의 수소결합과 일부의 공유결합>>안정화 유도
    =>다수의 hydroxyproline에 의해 수소결합; 구조의 안정화
    =>ascorbate 결핌은 >> 질병을 유발함
=또 하나의 예는 단백질 활성의 조절에 기여
 -phosphorylation
    =>serine, threonine, tyrosine의 hydroxyly 그룹에(5.13)
        =>by protein kinases
           =>인산기는 ATP와 같은 triphosphate가 제공
    =>dephosphorylation by phosphatase
        =>단백질의 불활성화 유도

                          protein Kinase
 (inactive form) + Pi <========> (Active form)
                          phosphatase
 예) glycogen metabolism by cAMP-dependent protein kinase는 glycogen phosphorylase
      kinase에 인산기를 넘겨주므로   활성 유도
      => glycogen synthase의 불활성화
          => 이는 인산기룰 받아 불활성화됨.

5.4.3. Glycosylation
=탄수화물의 부착을 말함
 - glycoprotein을 형성함.
 - polypeptide에 따라서 2 - 20%까지 함유 유도.
 - 그 형태는 oligosaccarides unit가 붙는 형태
   =>이를 glycan이라 부름
   =>잔기수도 다양/가지형태도 다양 (5.14)
=단백질의 전체적인 형태형성에 영향을 줌
 - 분자의 중요한 특성을 유도할 수도 있음
=모든 진핵생물과 바이러스에서 관찰되나 박테리아에는 불특정.

=Two major group;
 - polypeptide와 탄수화물간의 화학적 연결 방법
  1) O-linked oligosaccaride; thre./ser.의 산소에
   - 비교적 간단하나 다양한 구조 형성
   - 당은 galactose/N-acetylgalactosamine (5.16a)
  2) N-linked oligosaccaride; asparagine의 amide N
   - 다소 복잡한 구조로 여러 종류의 sugar로 (5.16b)
= Glycan은 다양한 수의 잔기와 형태를 함 (5.17)

<The biosynthetic pathways for O- and N-linked oligo..>
=두 경로가 있으나 모두 매우 다르다.
 1) O-linked side chain; polypeptide에 직접 합성됨.
  - glycan은 glycosyl transferases에 의하여 시계 방향으로 누적됨.
    =>기질은 UDP-galactose 등 n.t. mono- /diphosphate sugar derivatives (5.18)
  - O-linked glycan의 합성 경로 (5.19)
    =>골기체에서 일어남.
 2) N-linked oligosaccharides(glycan)는 다름
  - dolichol (5.20) 이라 불리는 불포화 지방산에서 합성된 oligosaccharide전구체로부터 생성.
    => 소포체내에서 일어남.
      => nucleoside diphosphate sugars 또는 dolichol phosphate sugar가 기질; by
          glycosyl transferases
          => 주로 asparagine에 부착; to Asn-X-Ser or Asn-X-Thr
               => 보다 복잡 (5.21)

<Functions of glycans>
=정확한 기능이 연구되고 있다.
 - 많은 경우에 glycoprotein의 형태유지에 역할을함
  =>예로써, 효모의 non-glycosylated invertase는
    변형된 것보다 쉽게 열에 파손됨
=glycosylation은;
 - 단백질의 형태 유지.
 - 단백질의 용해도를 높임.
 - proteases에 의한 분해로 부터 단백질의 보호.
 - 세포내 정해진 위치의 인식 및 수송에 관여.
  (표 5.4; glycoprotein의 생물학적 기능)
  (표 5.5; glycosylation의 결손에 따른 질병)

5.4.4. Acylation
=Long-chain fatty acids의 첨가
=진핵생물에서는 glycosylation만큼 중요. (표 5.2)
=대표적인 두가지 형태;
 1) fatty acyl group과 serine과 threonine의 측기 간의 ester bond  또는 fatty acyl group과
     cisteine사이의  thioeser bond
  - 가장 많은 부착되는 acyl기는 palmitate와 약간의 stearate, oleate, myristate 등 (5.22)
    =>acylated 단백질은 대개 세포막과 관계함
  - 지방산의 측기는 이중막 내로 단백질의 함입에 참여하는 것으로 생각됨.
    (예) 뇌의 proteolipid, transferrin receptor protein, 많은 virus의 coat protein(virus capsid의
          지질막과 관계); 숙주내 감염에 유효한 역할을 함.
 2) N-말단 glycine의 아미노기에 myristate의 첨가 (5.23)
  - 단백질의 해독이 완성되기 전에 일어남.
    => so called cotranslational midification
    (예) cAMP-dependent protein kinase

5.4.5. Processing of proteins by proteolytic cleavage
=제한적이며 특이적인 단백질의 가수분해
  -독특한 활성을 갖거나 한번의 활성 단백질 생성
  (예) 많은 peptide 호르몬은 뇌하수체의 전/중엽으로 부터 합성되는데, 이들은
        전구체 polypeptide인 proopimelanicortin과 proencephalin의 선택적 가수분해로 생산됨.
        (5.24)
        => proopimelanicortin은 다른 두 엽에서 다른 경로로 다른 호르   몬을 생성함.
            => ACTH는 전엽에서, 알파-melanocyte 자극 호르몬 (ACTH의 아미노 말단의
                분절)은 중엽에서  생성됨.
                =>proopimelanicortin과 proencephalin는 polyprotein임
=절단은 염기성 a.a.를 구성하는 dipeptide에서 일어남.
  - 주로 Arg-Arg, Lys-Lys 및 Lys-Arg 양쪽에서 잘림.
=분비 단백질은 숙주내에서는 억압상태로 존재.
  - 예로 벌의 독 melittin (from promelittin).
     => melittin은 pro-보다 N-말단 쪽에 22 a.a.가 짧다.(5.25)
         =>11개의 dipeptide가 잘려나감; A-B 연쇄로 형성
            =>A; alanine, aspartate, glutamate
     => B; alanine, proline
=Insulin과 glucagon은 전구체로 합성됨
     =>효소활성은 일부가 잘려나감으로 시작됨. (5.26)

6.2. The lactose operon
=lactose; galatose + glucose; 유당(우유)
  - joined by beta-glycosidic link (6.2)
=대장균에서는 이를 대사하기 위해 두개의 효소를 필요
  - b-galactoside permease; 세포내로 수송
  - b-galactosidase; 당(sugars)으로 가수분해
    =>glucose는 가장 쉬운 대사물질; 바로 해당경로로 도입됨.

= Lactose를 소화하지 못하는 변이균주를 이용한 실험
  - complementation test (6.3)
    lacZ: b-galactosidase gene
    lacY; b-galactoside permase gene
      =>w/o lactose condition; 두 유전자의 활성 0
      =>w/ lactose; 작동개시
    induction by lactose (6.4)
    glucose analogue (표 6.1)
    gratuitous inducers; IPTG
  - 그림6.5; ONPG, IPTG
  - 그림6.6; Mutant test(constitutive expression lacZ)
  - 그림6.7; 돌연변이의 원인
  - 조절유전자; lacI, lacO
  - 돌연변이가 일어나면; lacI-, lacOc
     =>이들은 구조유전자를 조절

 = operon system in bacteria
   - lac operon; 그림 6.8; lacZ, Y, A; 구조유전
   - lacI, O; 조절유전자
   - lacP: promoter
      => 이로부터 구조유전자의 mRNA합성 개시
      => single mRNA; polycistronic mRNA
         =>coordinate regulation

= Jacob and Monod; cis-trans test
  -mutant + plasmid (contain lac operon)
    =>가상의 diploid를 만듬.
       =>called partial dipliods or merodiploids
          =>I+(wild type), I-(mutant, constitutive)
    =>Two different merodiploid (6.10a,b)
   a) cis-형; lacI와 lacZ가 동일 염색체상에 존재
   b) trans-형; lacI와 lacZ가 상이한 염색체상에.
      =>phenotype은 정상적인 wild-type response를 보이므로 I+가 I-에 대하여 우성임
      =>어떤 염색체상에 있거나 무관함
      =>즉, lacI는 trans-dominant
      =>lacI는 repressor protein을 합성 방출
         =>즉 repressor임.
      => 그러나 lacO의 경우는 lacZ 유전자의 조절과 무관하여 cis-dominant라함
           즉, phenotype은 동일 염색체 위의 lacO allele에 의존하기 때문임. 따라서 lacO의
           돌연변이도 구조유전자의 발현에는 영향을 주지 않음.
           =>이를 operator라 부름.

<The Model>
=lac repressor는 단백질임.
 - allosteric protein
   => IPTG와 같은 inducer가 없을 경우 이 단배질은 operator에 결합하여 RNA polymerase에
       의한 구조유전자의 전사를 저해함.(6.11)
   => IPTG의 존재시 reprossor단백질의 모양 변화를 유도; operator에 결합 불가
   =>전사개시

=lac- mutation; make altered repressor proteins
=lacOc mutation; altered base seq.로 인하여 repressor가 인식불가

<The isolation of the lac repressor>
=lactose repressor의 정제
 - by equilibrium analysis (6.12)
 - by filter binding assay (6.13)

=완전한 lactose operon의 DNA염기서열이 밝혀짐.
 -lactose(inducer)가 없을 때, repressor tetramer는 lacO seq.를 인식함 (6.14)
   =>이 부위의 염기서열은  inverted repeated seq.(also called dyad symmetry)
   =>DNA seq. is repeated on the opposite strand but with the same 5’ >>> 3’direction.
   =>DNA 결합단백질의 DNA결합부위를 인식하는 공통적 특징
   =>operator는 부분적으로 repressor와 RNA polymerase가 동시에 결합할 수 없도록하기
      위하여 overlap되어 있다.
   =>repressor의 operator에 결합은 매우 견고.
   =>IPTG에 의하여 해리가 가능함.

<Allolactose>
=an in vivo inducer (6.15)
 - formed by minor reaction of beta-galactosidase
    =>공식명칭; galactoseb1-6glucose (lactose는 galactoseb1-4glucose)
   =>이는 melibiose (galactosea1-6glucose)가 왜  lac operon을 유도하는지 알게한다.

<Background synthesis>
=최소량의 합성이 있다.
 -이것이 lactose를 도입하고 allolactose로 변화시킴.
  =>induction이 가능하게함.

<Galactoside transacetylase>
=lacA gene의 산물로써, lactose 이외에 galactoside를 제거하므로 축적 과 독성화를 방지.
 - detoxifies these compounds by acetylation.

6.3. Catabolite repression
=diauxic growth; glucose first, lactose second (6.16).
 - or called glucose effect
 - lactose 소모를 위한 효소생산을 하지 않으므로 에너지 효율을 높임.
 - 이러한 억제자는 glucose가 아니라 unknown catabolite; called catabolite repressions
 - 이는 전사의 억제이다; major saving energy

(실험)
=glucose의 첨가는 nucleotise cAMP의 농도가 급감
=glucose+lactose배지에 cAMP의 첨가로 lac operon의 유도
 -다른 operon에서도 동일함.

=중요한 또 하나는;
  - ATP를 cAMP로 변환시키는 adenyl cyclase (cya)를 전이하는 유전자에 돌연변이는
    pleiotropic을 유발함.
  - catabolite에 민감한 모든 operon이 정지됨.
  - cyclic AMP의 첨가로 회복됨.

=정확한 기작은 불분명;
  - may be glucose의 대사물질 or NADPH/NADP+ 비율 ?

=cAMP level의 조절은 다음으로 가능함;
  - adenyl cyclase의 저해로
  - 또는 phosphodiesterase (cAMP를 AMP)의 자극.

=cAMP가 어떻게 전사에 영향을 주는가?
  - cAMP 단독은 아닐것.
  - cAMP binding proteins;
     =>CAP (catabolite gene activator protein) or
     =>CRP (cAMP receptor protein) (6.18)
     =>CAP(crp)의 돌연변인는cya-와 같이 pleiotropic
  - 어디서 작동하는가?
     =>promoter; CAP acts at the promoter directly
     =>대장균에서와는 달리 진핵생물에서는 cAMP-dependent protein kinase를 경유하여
        작용.

<Promoter structure>
=Pribnow box; TATAAT at -10
=Another one; TTGACA at -35
 - RNA polymearse의 결합과 전사의 개시에 반응.

 ***Catabolite sensitive promoters***

6.4. The tryptophan operon
=대장균에서 배지에 tryptophan 존재시에는 자체생산중단
  - repress, lac operon과는 반대.

=A complex operon; 5개 구조 유전자를; trpE -trpA (6.19)
  - subject to feedback inhibition with tryptophan
  - 합성경로의 첫번째 효소의 활성을 저해.
     =>tryptophan은 anthranilate synthetase 활성 저해.

=Not subject catabolite repression
  - 이는 생합성과 관계되기 때문.

=trpE로 부터 개시하여 trpA로 연결되는 polycistronic
  - show coordinate regulation

=tryptophan이 직접 DNA와 작용하여 저해하지는 않음.
  - tryptophan은 corepressor로서 aporepressor 단백질과 결합하여 holorepressor를 형성,
    이것이 전사를 억제
  - tryptophan-protein complex; called holorepressor

=trpR유전자는 구조유전자들과 동떨어져 있음.
=돌연변이의 발견; trpR or trpO
  - Wild-type trp+는 trp-에 대하여 trans-dominant
  - trpOc는 cis-dominant; trpR의 repressor는 trpO에 결합

=lac operon과의 차이;
  - lactose는 lac repressor를 불활성화하는 반면 tryptophan은 operator DNA에 대한 trp
     repressor의 affinity를 증가시킴.
  - DNA에 결합을 가능케하고 전사를 억제 (6.20)

<The repressor protein>
=a tetramer of 4 identical subunits
 - Mr 12,000 each
 - 각 subunit은 tryptophan분자와 결합 가능.

=holorepressor는 operator dyad symmetry의 DNA seq.에 결합
 - dyad DNA seq.는 promoter의 -10부근에 완전히 겹치는 부분임. (6.21)
 - 이는 repressor가 RNA polymerase가 점유하는 promoter를 저해  하는 것으로 해석됨.

6.5. Attenuation; Second method of regulating gene expression
=trp operon은 또 하나의 유전자 발현 조절인자가 있음.
 - trp operon의 mRNA합성은 trpE의 개시 코돈의 161염기 앞에서 전사가 시작됨.
 - trpE 바로 앞 부분이 제거된 (trpE와 trpO는 완전) deletion mutant에서는 6배 높은 전체
    trp-operon의 발현을 관찰함.
 - trp DNA의 in vitro transcription에서는 대부분의 mRNA가 139   염기로 종결됨.
    => 전사체는 trpE에 도달하지 못함.
    => in vivo에서도 유사한 결과를 관찰함. 이는 구조유전자 직전에 효율적인 전사의 방해가
        있음을
        의미; 이 방해물도 전사됨.
    => 이 방해물 seq.가 제거되면 전사는 훨씬 효율적으로 진행됨.
 - 이러한 trpE 앞의 긴 mRNA를 leader (trpL)라 하고,방해물은 attenuater (trp a)라 함.
 - 전사종결(attenuation)은 환경에 tryptophan의 양에 의존.
  =>low tryptophan; more mRNA to proceed past the attenuator
  =>entire operon is transcribed.

=another method of controlling gene expression

6.5.1. The trp leader
=trpL의 DNA seq를 확인하므로 몇몇 특징이 드러남.(6.22)
 - 3개의 dyad symmetry seqs.
 - 이들은 trpL로 부터 mRNA가 전사되게하며, stem-and-loop 구조를 형성하도록함 (6.23)
 - 이러한 seq는 많은 DNA와 RNA에서 관찰됨.
   =>form of hairpin bends and crucifirm 구조.
 - trpL stem-and loop formation; regions 1,2,3,4,
   =>1+2/3+4 can pair to form 첫번째, 세번째의 stem-and-loop형성
   =>2+3 pair; 또 다른 stem-and-loop형성.한번에 3개의 stem-and-loop형성은 불가함.
       =>서로 겹치므로; 매우 중요함.
 - 세번째의 s-n-l은 trpE와 가장 근접; 중요 (6.24)
   => stem은 G-C염기쌍이 풍부함.
   => 모두 3중 수소 결합을 형성; 견고하고 안정. 그 뒤로 일련의 uridine잔기가 이어짐.
       => 이는 전사의 종결신호.
    => 이는 세번째 s-n-l가 기능적 attnuator임.

=또 한가지의 특징;
 - codes for translatable 14 a.a. peptide (6.22)
 - 이 안에는 2개의 연속적인 tryptophan codon을 포함.
    =>매우 기이한 현상 (매우 드물게 사용되는 a.a.
    =>다른 a.a의 생합성관련 operon의 leader와 유사함

=어떤 조절에 따라?
 - 해독되는 polypeptide coding region의 존재로?
 - mRNA의 2차 구조로 ?

6.5.1. The regulation of transcription termination
=attenuator s-n-l구조 형성의 허용이나 저지냐에 달림.
 (1) in vitro에서 trp leader부분이 전사되면
  (translation이 없으면), 모든 전사체는 attenuator에서 종결됨
  - 전사가 진행되면 1+2는 첫번째의 s-n-l형성하고, 세번째(attenuator)의 3+4 s-n-l도
     형성함.
     =>but not second
     =>attenuator가 형성되면 전사의 종결이 일어남.(6.25a)
 (2) in vivo에서 해독이 이루어진다면 어떤가?
  - 진핵생물에서는 실제 동시에 이루어진다.
     =>14 a.a peptide에 대한 codon은 첫번째의 s-n-l과 겹침
         (특히 두개의 tryptophan codon 포함)
     =>즉 leader는 전사와 동시에 해독이 시작됨
  - 따라서 과도한 tryptophan의 존재시에 polypeptide는 완전 해독.
    =>ribosome이 정지신호에 도달하면, 첫번째의 s-n-l구조는 전사된다. (6.25b(i))
    =>두번째 s-n-l는 형성 불가(ribosome이 두번 째 loop 형성을 방해하므로) (6.25b(ii))
    =>또는 loop가 완전히 전사되지 않아서 (6.25a(i)과 유사)
  - 결국 leader전체가 전사되고 attenuator가 전사 종결.

6.5.2. Attenuation and  tRNA
=ryptophan의 결핍은 tryptophanyl-tRNA TRP complex의 제한.
 - 전사는 시작되나 tryptophanyl-tRNA TRP결핍으로 지연/정지.
 - 정지하고 있는 ribosome은 첫번째의 s-n-l 형성을 저해함(6.25c(i))
 - 2와 3이 전사되면서 두번째의 s-n-l을 형성함.(6.25c(ii))
  =>이는 4의 전사체가 3이 2와 이미 s-n-l을 이루므로 attenuator loop을 형성하지 못함.
  =>이는 종결신호가 생기지 않아, RNA polymerase는 계속 전사를 하여 완전한 operon을
     작동함; tryptophan 합성!!!

6.5.3. Prevalence of attenuation
=생합성과 관련한 operon은 대개 leader region을 가짐.
 - his, leu, ilv operon등의 경우.

7.1. Introduction
=complex
 - large genome
 - 염색체; associated with histones + other proteins (7.1)

=전사와 해독이 시간/공간적으로 분리되어 있음.
 - 전사는 핵, 해독은 세포질; all require processing

7.2. Size of eukaryotic genomes; the C-value paradox
=DNA 염기서열의 배열
=more DNA in euk.
=C-value; 한 생물 종의 반수체에 존재하는 DNA의 양.
 - complexity; 한 개체군내 unique DNA seq.의 총 길이.
   =>효모는 대장균의 4배, 초파리는 효모의 6배
   =>사람은 초파리의 20배

=박테리아 제놈은 대부분 발현됨.
 - 대부분 constitutive expression

=C-value paradox; 고등생물의 제놈이 모두 유전자로 작용하지 않는다는 역설. (표 7.2)

7.2.1. Kinetic analysis of genomes
=genome내 DNA 염기 서열의 구조에 관한 정보.
 - after denaturation

=절차; DNA를 350 bp 길이로 분절화 >> heat-denatured >> DNA를 융점이하로 온도 강하
          >>reassociation 유도
  =>즉, 상보적 가닥간의 renaturation을 관찰; plotting
      =>log10 of Cot (Co; 초기 DNA농도, t; 시간)

=complexity; genome내 별개의 유전자들이 갖는 염기수
    (unique seq의 총 길이)
 - complexity가 높을 수록 재조합의 속도는 느려짐.
    =>반복된 DNA가 많을 수록 complexity는 genome size보다 낮아짐.
    =>unique seq를 반영함
  예: 다른 세가지;  각각 1,000인 A, B, C =3,000
       다른 두 가지; 각각 1,000인  A, B가 각각 1개씩 2,000 +
                          C는 10개 = 12,000
                       =>complexity는 모두 3,000
 -Genome I; 7.2a, Genome II; 7.2a, Genome III; 7.2b

7.2.2. Kinetic analysis of eukaryptie genomes>
=진핵생물은 단순한 sigmoidal curve를 나타내지 않음.
 - 복잡한 곡선 그래프와 광범위의 Cot값을 가짐
  =>대개 3개로 구성됨. (7.3)

 (1) The first component;
  -수백 - 수천의 염기쌍으로 구성되는 DNA들임
  -대장균 보다 훨씬 단순함.
  -진핵생물 전체 제놈의 10% 이상을 차지함.
   =>한 종의 제놈이 10⁹bp이고 복잡도가 1,000bp;
      =>10%를 차지 한다면; 이는 10⁸ bp임
        =>즉 10⁸/10³ = 10⁵회 반복된 것임.
  -반복성 DNA가 반드시 1,000bp로 구성되는 것은 아님.
   =>그리고 한 종류로 반복된 것도 아님.
     =>대개 여러개의 작은 구성원이 복합됨.
  -평균 10⁵의 빈도로 반복됨

 (2) The second component;
  -10 - 30% of euk. genome
  -복잡도는 대개 10⁴ - 10⁶ bp
  -반복정도; 10² - 10⁴
  -several family로 대표됨.
  -중간 정도의 반복적 DNA

 (3) The third component;
  -약 50% 차지
  -비반복성 또는 unique
=하등생물일 수록 반복성 DNA의 양이 적다.

<Highly repetitive DNA>
=Known as satellite DNA; 분리 침강시 satillite band를 형성.
 - long arrays of tandem repeats
    =>진핵생물 제놈의 모든 염색체에 존재; very short
 - 초파리에서는 25%의 DNA가 ACAAACT연쇄임.
    =>10⁷ copy 이상이 존재함
    =>또한 다른 두 가지의 satellite를 가짐
       =>각각 8% 이상을 점유함.
 - 고등생물에서는 보다 길다
 - heterochromatin에서 발견됨; 세포주기 전기간 동안 고도로 응축되어 있음 (체세포
   분열중인 염색체처럼).
    =>유전자를 포함하는 부분은 물리적으로 느슨한 상태의 euchromatin.

<Moderately repetitive DNA>
=수 백 bp의 길이로 구성
=제놈내에 분산되어 있음
=수 백개의 family로 구성되어 있음.
 - 50 - 10⁵ repeates
 - 가장 큰 것의 예로써 사람의 AluI seq.
    =>300 bp의 반복 단위체내에 AluI site가 있음.
    =>3 x 10⁵회 반복되어 나타남 (in haploid)
       =>human genome의 3%를 차지함.
 - 또 하나는 6,400 bp seq. 반복체로써 3,000 - 4,600회 반복되어 있어 인체 DNA의 1%를
   차지함.

7.2.3. Genes and gene families
=rRNA gene family; 총 RNA의 80% 점유.
 - multiple copy로 존재함
 - 모든 진핵생물에서 18S와 28S rRNA가 단일 전사체로부터 생성됨; 그 유전자는
    연쇄적으로 반복됨.
     =>1 개 이상의 cluster내에 수 백회 반복 존재.
       =>초파리의 경우 (7.4)
          =>5S 또한 반복된 cluster로 존재.
            =>종 마다 1000 - 20000까지 반복.

=단백질 전이 유전자로는 histone protein genes
 - multiple copy로 존재
    =>대부분 포유류에서는 10 - 40 copies
      =>초파리는 100개, 양상치는 수 백개
         =>histone유전자의 규성은 종 마다 크게 다르나 모두는 집단으로 존재.
            =>5가지의 histone 유전자가 반복존재 (7.4b)

7.2.4. Clusters of related genes
=척추동물에 두 종류 globins; 알파, 베타는 한무리에 존재
 - 밀접히 관련되어 있으나 다른기능과 함께, 생활사 동안에 다른 시기에 발현
 - 각 유전자 무리들은 한 유전자의 배가로 발생한 것으로 추정됨.
    =>알파, 베타 유전자는 각각 하나의 원시 글로빈 유전자로부터 복사되어 생김.
 - 베타-like globin genes의 무리 (from rabbit); 그림 7.5
    =>여기에는 4개의 베타-like globin seq.가 있음.
       베타1; 성체에서 발현
       베타3, 4; 배발생시에 활동
       베타2; pseudogene; 본래 기능을 했으나 진화중에 여러 종류의 변이로 활동 중단.

 - 또 다른 슈도 유전자; 인간의 베타 튜블린과 개구리의 5S rRNA 유전자, mRNA유사성 seq.
   =>processed 슈도 유전자는 intron이 없음.
   =>3’말단에 poly(A) tract를 가짐.
      예로는 globins, tublins, cytochrome C; 이들은 mRNA의 역전사에 의한 제놈내 도입 으로
      추정되며 이들은 gene cluster내에 있지 않고 다른 염색체에 위치함. 그러나 대부분의
      단백질 생산 유전자는 단일 카피로 존재 하더라도 풍부  한 단백질 생산력이 있다.

7.3. Specialised regions of chromosomes
7.3.1. Centromeres
=세포분열 중기 염색체의 함입부위
=Spindle fiber가 부착하는 곳
  - 염색체의 정확한 분할을 위하여 중요함.
=많은 양의 sattlite DNA가 발견됨.
  - 효모의 세 가지 염색체에 있는 것; 7.6
     =>AT-rich; 80-90 bp seq.; flanked by two shorter conserved seq.

7.3.2. Telomeres
=원핵이나 진핵의 노출된 선상(linear)DNA는 매우 불안정.
=박테리아는 원형으로 이로부터 탈출함; lacks free ends
=진핵 생믈의 염색체는 linear로 말단을 telomeres라 함.
  - 따라서 말단이 보호되어야함.
     =>단순하며 반복적인 G(1-4) T(1-4) 를 형성함.
        =>50회 이상의 반복된 GGGGTT seq.; 이 부분이 어떻게 복제되는가는 수수께끼
            =>주형 없이 생성되는 듯함; by hairpin formation (7.7)

7.4. Gene expression in eukaryotes
=진핵생물; 수 백가지의 세포의 형태를 가짐.
 - 특정한 형태의 세포는 그들이 가지는 특정한 단백질과  그 양에 따름.
    (abundance and nature).
 - 예; globin gene은 erythroid cell에서만 발현됨.
    =>cell type specific and developmentally regulated
    =>some are constitutively expressed (house keeping)
   =>모든세포에서; cytoskeletal proteins 및 대사 관련 효소.

7.4.1. How many genes are expressed in euk......
=약 2 - 5%만이 발현됨; 닭을 예로들면; DNA는 4.1%
 - 제놈 중 9.4 x 10⁸ bp가 non-repetitive DNA.
  =>이것의 4.1%는 3.86 x 107 bp
  =>평균 mRNA크기가 2,000 nt. (7.8)
   =>약 19,700 genes expressed.
=평균 7,500 - 20,000 개의 유전자가 발현됨.
 - 효모는 4000개가 발현됨.

7.4.2. Cloning of cell-type specific genes
=cDNA clones of cell type specific genes
 - differential screening (or +/- screening); 7.9
=전체 mRNA의 5-10%가 고등생물의 세포특이성을 대표함.
 - 고등생물은 3만 - 5만 유전자를 가짐.

7.4.3. Abundance classes of mRNAs
=유전자들이 모두 같은 정도로 발현되지 않음.
=3가지의 mRNA;
 - high; 100 이상; mRNA의 약 33%를 점유; 각각은 1%
  =>닭의 난관 세포내에는 50% mRNA가 하나의 ovalbumin 유전자 산믈임.
  =>특정 세포의 표현형은 한 두가지의 매우 풍부한 단백질에 의해 나타남.
      =>reticulocytes에 globins, 근육세포에 actin과 myosin
 - moderate; 약 33%점유; 각각은 0.1 - 0.5%를 점유
 - low; 약 1만 전사체; 각각은 0.01% 점유
  =>대부분은 housekeeping genes product (표 7.2)

7.5. Levels of control of gene expression in eukaryotes
=Gene expression is modulated. (7.10).
 - 전사 초기에 조절이 가장 경제적이고 확실함.
 - Run-off transcription으로 확인 가능함. (7.11)
  1) 특정 조직으로 부터 핵을 분리
  2) 방사능 표지된 dNTP와 함께 처리
  3) 반응조건에 따라 전사가 사작된것은 완료되나, 새로운 전사는 일어나지 않음.
  4) 표지된 mRNA를 탐침으로 나일론막에 부착된 분리된 DNA와 혼성화함
  5) 부착의 유무는 특정조직에서의 유전자 발현의 유무를 나타냄.
      =>예로써, serum albumin 유전자는 간조직에서는 발현되지만, 신장과 뇌에서는 없다.

7.5.1. Post-transcriptional regulation of gene expression
=대부분의 유전자는 전사의 개시 시점에서 조절됨.
=또한 post-transcriptionally
 - RNA polII에 의한 전사체는 모두 capped
 - 이들중 25%만이 polyadenylated
    =>polyadenylation이 전사를 조절하는가 ?????

=동일한 하나의 전사체로 부터 exon의 조합에 따른 splicing에 의하여 다른 종류의 mRNA가
  생성되는 일이 많다.
 - Splicing의 양상은 발달단계에 따라 다양하게 바뀜.
  =>초파리의 tropomyosin(근육단백질)의 경우. (7.12)
  =>성체는 5 exons,
  =>배는 4 exons; shortened carboxy-terminus

=mRNA의 안정성이 조절의 한 부분임.
 - 반감기를 16 - 300 시간까지 조절가능함.

7.6. Control of transcription of eukaryotic genes
=DNA seq.
=RNApolymerase II

7.6.1. cis-acting DNA seq.
=promoter and enhancers

<진핵생물의 promoters>
=TATA- box (or Goldberg-Hogness box); at -30 bp
 - TATAAAA seq.; 전사의 개시부
 - 강력한 발현을 요하는 유전자에서는 공통적임
  =>그러나 빈도가 낮고 housekeeping gene과 같은 경우에는 이것이 없다.

=CAAT -box; at -70 bp
 - CCAAT seq.
 - 양방향으로 작동하고 CTF protein과 상호작용

=GC-box(or Spl box); at upstream, 여러개가 존재하기도함.
 - GGGCGG seq.
 - housekeeping genes에서 주로 발견됨.
 - also in SV40 (7.14).
 - 양방향으로 작동
 - Spl protein과 상호작용함.

=그림 7.15; 진핵생물의 promoters

<Enhancers>
=promoter의 활성을 100 배 이상 촉진.
=위치에는 유연성이 있음.
=booster
 - up/down stream; either direction
 - 최초의 것은 SV40; ay -200 bp
    =>72 bp direct repeat
 - also in IgG heavy-chain genes, albumin genes

7.6.2. Sequences imparting cell-type specifity